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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志

年5月第55卷第5期

雒红霞孟亚萍韩海阳乔瑞红张小宁冯彦

医院耳鼻咽喉头颈外科

王浩江

山西医科大学基础医学院

王彤

山西医科大学公共卫生学院

蒿花粉变应原种类繁多，南北差异很大，是我国长江以北地区及欧亚丝绸之路沿线国家重要的致敏原。目前国内外尚未见关于黄花蒿花粉与鼻黏膜屏障功能关系的研究，黄花蒿花粉致敏的潜在致病机制仍不明确。

本文旨在分析黄花蒿花粉干预后HNEpC紧密连接蛋白表达的变化，试图从鼻黏膜上皮屏障功能层面分析黄花蒿花粉导致变应性鼻炎的发病机制，为蒿属花粉引起的变应性疾病的防治提供依据。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

HNEpC；胎牛血清；DMEM培养基；p38丝裂原素活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)信号通路特异性阻断剂SB；兔抗p38MAPK多克隆抗体、兔抗Phosphop38MAPK-T/Y抗体；兔抗OCLN多克隆抗体；免抗Claudin-I单克隆抗体；羊抗鼠IgG(H+L)HRP；鼠抗B-actin单克隆抗体；Vazyme反转录试剂盒，SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(quaniativereal-timePCR，qPCR)反应液；CCK8试剂盒、HRP标记的山羊抗兔lgG、异硫氰酸荧光素(uoresceinisothioeyanate,FITC)标记的山羊抗兔IgG；多功能酶标仪；共聚焦显微镜。

二、黄花蒿花粉采集制备

5mg/ml黄花蒿花粉原液购自杭州艾乐吉生物科技有限公司，具体制备流程如下：从山西省太原市采集黄花蒿花粉颗粒，根据Chen等的方法，通过克隆和测序花粉基因组DNA上的IIS2来确认所提取黄花蒿花粉的真实准确性。将2g花粉颗粒重悬于35mlPBS缓冲液中制备成花粉水蛋白提取物，并且在4C下摇晃12h。提取液于4°C、Xg离心10min，使用0.22μm的过滤器过滤提取物，用BCA法测定花粉提取液的最终质量浓度为5mg/mlo

三、HNEpC培养与刺激

HNEpC使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37C、5%CO，恒温培养箱中培养，待细胞80%融合，加入不同浓度黄花蒿花粉干预24h后，提取蛋白和RNA，进行相关指标的检测。共分为8组，分别为正常对照组、20、40、80、、、μg/ml黄花蒿花粉组和SB+μg/ml黄花蒿花粉组。SB+μg/ml黄花蒿花粉组使用50μumol/Lp38MAPK抑制剂SB预处理细胞1h后，再用μg/ml黄花蒿花粉干预24h，提取蛋白和RNA进行分析。

四、CCK-8法检测HNEpC的增殖活性

HNEpC消化后调整密度为个/ml，96孔板中每孔加入μul细胞悬液。培养24h后，加入不同质量浓度(0、20、40、80、、、μg/ml)黄花蒿花粉分别处理6、12、24h,同时以未加任何处理因素的HNEpC组作为对照组，每组设5个复孔，每孔加入10μulCCK-8溶液，继续孵育1h，在酶标仪上测定nm的吸光度值(A)。计算每组吸光度平均值。细胞活力=(A处理组一A空白组)/(A对照组一A空白组)。

五、免疫荧光化学染色法观察HNEpC紧密连接的表达与分布

HNEpC接种于已放入细胞爬片的24孔板中生长，待细胞生长融合至60%左右，按上述干预条件处理细胞24h。4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS漂洗3次，加人5%BSA封闭液，37C孵育30min，弃去多余的液体，加入一抗稀释液Ocludin(1:)和Claudin-1(1:)，4C摇床孵育过夜，次日弃去抗体，PBS漂洗3次，暗室C孵育荧光二抗(1:)30min，PBS漂洗3次，滴加DAPI染液，避光孵育10min，PBS洗涤3次，夹取细胞爬片，抗荧光衰减封片剂封片后于荧光显微镜下观察并拍照。

六、qPCR法检测紧密连接蛋白Occludin和Claudin-ImRNA水平

(一)引物设计

目的基因及内参18s引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

(二)细胞总RNA及cDNA提取

Trizol法裂解细胞，通过0D/0D比值检测提取总RNA的纯度,并得出浓度。每样本取ngRNA，使用HiSeriptRQRTSuperMixforqPCR试剂盒(Vaxzyme)反转录成cDNA。每管总体积20μl，反转录条件为50C.15min，85C、2min。

(三)扩增反应

按照试剂盒说明书配qPCR反应体系，按照预变性(95C、30s)，循环反应40次(95C、10s；60C、30s)，溶解曲线(95C、15s；60°C，60s；95C、15s)设置qPCR反应条件。根据2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量[△△Ct=(实验组目的基因CT-实验组内参基因CT)-(对照组目的基因CT-对照组内参基因CT)]，每组3个复孔，结果取平均值。

七、WesternBlot法检测细胞p38MAPK、pP-p38MAPK、紧密连接蛋白水平

P-p38MAPK是磷酸化p38MAPK，为p38MAPK的活化状态。收集细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔上样30μug总蛋白，1*loadingbufer补齐至相同体积，70V浓缩胶90V分离胶跑电泳，mA恒流转膜1h，5%脱脂奶粉封闭1.5h，分别加人目的蛋白一抗(1:)，4C孵育过夜。次日TBST洗膜3次，每次15min。辣根过氧化物酶标记的二抗(1:0)室温孵育1.5h，加ECL发光液曝光。用PhotoShop6.0软件对蛋白条带进行灰度分析。

八、统计学方法

所有数据均采用SPSS21.0分析，GraphPadPrism7.00绘制作图。计量资料用均数+标准差(`x±s)表示，若多组数据同时满足正态分布和方差齐性，采用单因素方差分析，若不满足条件，则采取秩和检验分析；两组间数据比较，若同时满足正态分布和方差齐性,采用Bonfroni法分析，若不满足条件则采取两独立样本非参数检验。P0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、CCK-8法检测不同剂量黄花蒿花粉对HNEpC增殖活性的影响

与对照组相比，不同质量浓度(20、40、80、、、μug/ml)黄花蒿花粉干预HNEpC6h后，细胞增殖活性均增高，差异有统计学意义(P值均.0.05)；干预12h后，20、40、80、、μug/ml组的细胞增殖活性未见明显改变，差异无统计学意义(P值均0.05)，μg/ml组的细胞增殖活性降低，差异有统计学意义(P0.05)；干预24h后,20、40ug/ml组的细胞增殖活性未见明显改变，差异无统计学意义(P值均0.05),80、、、μg/ml组的细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(P值均0.05)，见图1。

图1不同浓度黄花蒿花粉干预鼻粘膜上皮细胞6、12、24h后对细胞增殖活性的影响a与对照组(即0μg/ml黄花蒿花粉处理组)比较。P0.05

二、免疫荧光化学染色检测黄花蒿花粉对HNEpCOceludin，Claudin-1表达及分布的影响

免疫荧光化学染色可见：正常对照组HNEpC的Oceludin和Claudin-1蛋白定位于其细胞膜上，围绕细胞膜形成环状结构，连续性完整。而随黄花蒿花粉干预浓度增高，紧密连接出现断裂模糊，表达水平下降，荧光染色信号明显减弱。与μg/ml黄花蒿花粉处理组相比，SB联合黄花蒿花粉处理组Occludin蛋白表达连续完整，但Claudin-1蛋白无明显改变(图2)。

图2不同浓度黄花蒿花粉及p38丝裂原素活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB对鼻黏膜上皮细胞OeludianCaudir-表达分布的影响细胞免疫荧光x

三、WesternBlot及qPCR法检测黄花蒿花粉对HNEpCp38MAPK、P-p38MAPK、紧密连接OceludinClaudin-1蛋白及mRNA表达的影响

与正常对照组相比，μg/ml黄花蒿花粉处理HNEpC24h后，可显著降低Oceludin蛋白及其mRNA表达水平(P0.05)。而20、40、80、、μg/ml黄花蒿花粉处理24h组与正常对照组相比，Oeeludin蛋白及其mRNA表达水平增高(P0.05)，见图3A,B,表2。

与正常对照组相比,40.80、.、μug/ml黄花蒿花粉处理24h组均可显著下调Claudin-1蛋白及其mRNA的表达水平(P0.05),见图3A，B,表2。

图3WestermBlot法检测黄花蒿花粉干预24b后鼻钻膜上皮细胞OcludinCadin-I.p38丝裂原素活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白的表达1为正常对照组(0ug/ml黄花蒿花粉处理组),2、3、4、5、6、7分别为20、40、80、、、μg/ml黄花蒿花粉处理组，为与对照组相比P0.05

A:WesterBlot电泳结果图;

B:Oeeludin和Cladin-1蛋白水平的半定量分析柱状图

注：a与正常对照组(0ug/ml黄花蒿花粉处理组)相比，差异有统计学意义(P0.05)，b与ug/ml黄花蒿花粉处理组相比,差异有统计学意(0CO.05)，SB为p38丝裂原素活化蛋白微酶(p38MAPK)抑制剂

与正常对照组相比，各干预组p38MAPK的表达差异无统计学意义(P0.05)，但、、μg/ml黄花蒿花粉处理组p-p38MAPK表达明显增高，差异有统计学意义(P0.05)，见图3A，C。

A：WesterBlot电泳结果图；

C：p38MAPK和p-p38MAPK蛋白水平的半定量分析柱状图

四、WestermBlot及qPCR法检测SB联合黄花蒿花粉处理对HNEpCp38MAPKP-p38MAPK、Oceludin、Claudin-1蛋白及mRNA表达的影响

与μg/ml黄花蒿花粉处理组相比，SB+μg/ml黄花蒿花粉组p-p38MAPK蛋白表达明显降低。紧密连接Oceludin蛋白及mRNA表达水平均增高(P0.05)，而紧密连接Claudin-1蛋白及mRNA表达水平未见明显差异(P0.05)，见图4，表2。

图4WesterBlot法检测p38MAPK抑制剂SB联合黄花蒿花粉干预24h后鼻黏膜上皮细胞Oeludin、Claudin-I、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达为μg/ml黄花蒿花粉处理组，2为SB+μg/ml黄花蒿花粉组，a为与ug/ml黄花蒿花粉处理组相比P0.05A：WesternBlot电泳结果图；

B：Oeclodin和Claudin-l蛋白水平的半定量分析柱状图；

C：p38MAPK和P-p38MAPK蛋白水平的半定量分析柱状图

注：与正常对照组(0μg/ml黄花蒿花粉处理组)相比，差异有统计学意义(P0.05)，a与μg/ml黄花蒿花粉处理组相比，差异有统计学意(0CO.05)，SB为p38丝裂原素活化蛋白微酶(p38MAPK)抑制剂

讨论

黄花蒿花粉是引起山西地区季节性变应性鼻炎最主要的致敏花粉。根据先前研究结果，本研究选取0、20、40、80、、、μg/ml黄花蒿花粉干预HNEpC24h,通过CCK-8法发现，不同浓度黄花蒿花粉干预时细胞活力存在差异。紧密连接Occludin，Claudin-1是构成鼻黏膜上皮物理屏障的主要分子。

大量研究阐明上皮紧密连接与变应性疾病发病密切相关，但对上皮紧密连接的调节方式存在大量的争议。例如有研究显示，尘蟎、花粉等蛋白酶变应原可通过破坏上皮屏障功能，下调紧密连接蛋白Occludin.Z0-1表达，促进变应性疾病的发生及进展；但已有研究在呼吸道合胞病毒干预HNEpC的实验中观察到，Oceludin，Z0-2等紧密连接蛋白的表达出现上调。

本研究发现,黄花蒿花粉可能通过激活p38MAPK信号通路下调HNEpC细胞间紧密连接的表达,从细胞分子水平为黄花蒿花粉引起的气道变应性疾病的治疗提供了实验支持。然而,变应性鼻炎发病机制复杂,信号传导通路众多，我们仍需将细胞分子与临床治疗结合,以找到缓解变应性鼻炎症状的新思路。

本